免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。今天上海恒远为大家整理了一些一些免疫组化的常见问题，下面我们来看看吧！

 1.在什么情况下使用TritonX-100？

(1)Triton X-100 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(>10um 厚切片)和免疫细胞化学中一般用Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。

(2)其作用原理：Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

(3)Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用

2.封闭血清的选择原则是什么？

(1)膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！(2)封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。(3)也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

3.抗体孵育条件的比较？

(1)一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37 度 1-2 h，而4度夜和从冰箱拿出后 37 度复温 45 min。(2)二抗一般室温或 37 度 30 min-1 h，具体时间需要摸索。

4.一抗 4 度孵育后为什么要进行 37 度复温？

(1)一方面，防止切片从 4 度直接放入 PBS 易脱片；(2)另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要, 但对表达较弱的抗原可能有用,4 度和 37 度时分子运动方式不同, 前者分子碰撞机率和运动速度小于后者, 后者结合更快, 但敏感性也提高了并易造成非特异染色。(3)其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏片子从 4 度夜拿出后，直接用 PBS 洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！

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