提示：

 

    次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!

 

    操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mlRLT中加入10μlβ-巯基乙醇。此裂解液现用现配。配好的RLT4℃可放置一个月。

 

    1.组织培养细胞

 

    a.收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。

 

    b.13，000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。

 

    c.轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入350μl（<5x106细胞）或者600μl（5x106-1x107细胞）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

 

    d.用带钝针头的一次性1ml（配0.9mm针头）注射器抽打裂解物5-10次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。

 

    e.接操作步骤项下3。

 

    2.动物组织（例如鼠肝脑）

 

    a.电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入350μl（<20mg组织）或者600μl（20-30mg组织）的裂解液RLT后电动彻底匀浆20-40秒。

 

    b.液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉（20mg/30mg）转入装有350μl/600μl组织裂解液RLT的1.5ml离心管中,用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性1ml（配0.9mm针头）注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。

 

    c.将匀浆后裂解物13，000rpm离心3分钟,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物,将裂解物上清小心转到一个新离心管。

 

    d.接操作步骤项下3。

 

    3.较精确估计裂解物（上清）体积,加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。

 

    4.立刻将混合物（每次小于700μl,多可以分两次加入）加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心60秒，弃掉废液。

 

    5.加700μl去蛋白液RW1，室温放置30秒，12，000rpm离心30秒，弃掉废液。

 

    如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。

 

    6.加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。

 

    7.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

 

    8.取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μlRNasefreewater（事先在70-90℃水浴中加热可提高产量），室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟。

 

    9.如果预期RNA产量>30μg,加30-50μlRNasefreewater重复步骤8,合并两次洗脱液,或者使用次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍（如果需要RNA浓度高）。

 

    洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。