1.融解ripa裂解液，混匀。取恰当量的裂解液，在运用前数分钟内参加pmsf，使pmsf的终浓度为1mm。

 

    2.关于贴壁细胞：去除培养液，用pbs、生理盐水或无血清培养液洗一遍(假如血清中的蛋白没有干扰，能够不洗)。按照6孔板每孔参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充沛接触。一般裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。

 

    关于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。再用手指轻弹以充沛裂解细胞。充沛裂解后应没有明显的细胞沉积。假如细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

 

    3.充沛裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的page、western和免疫沉积等操作。 

 

    裂解液用量说明：一般6孔板每孔细胞参加150微升裂解液现已足够，但假如细胞密度十分高能够恰当加大裂解液的用量到200微升或250微升。 

 

    关于安排样品： 

 

    1.把安排剪切成细微的碎片。

 

    2.融解ripa裂解液，混匀。取恰当量的裂解液，在运用前数分钟内参加pmsf，使pmsf的终浓度为1mm。

 

    3.按照每20毫克安排参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。(假如裂解不充沛能够恰当增加更多的裂解液，假如需求高浓度的蛋白样品，能够恰当减少裂解液的用量。)

 

    4.用玻璃匀浆器匀浆，直至充沛裂解。

 

    5.充沛裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的page、western和免疫沉积等操作。

 

    6.假如安排样品本身十分细微，能够恰当剪切后直接参加裂解液裂解，通过激烈vortex使样品裂解充沛。然后同样离心取上清，用于后续试验。直接裂解的优点是比较方便，不用运用匀浆器，缺陷是不如运用匀浆器那样裂解得比较充沛。 

 

    注：ripa裂解液的裂解产品中经常会出现一小团通明胶状物，属正常现象。该通明胶状物为含有基因组dna等的复合物。在不检测和基因组dna结合特别紧密的蛋白的情况下，能够直接离心取上清用于后续试验；假如需求检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则能够通过超声处理打碎打散该通明胶状物，随后离心取上清用于后续试验。假如检测一些常见的转录因子，例如nf-kappab、p53等时，一般不用进行超声处理，就能够检测到这些转录因子。